細(xì)胞消化傳代和換液傳代經(jīng)驗(yàn)
1、傳代時(shí)消化的問(wèn)題
可以這樣說(shuō)，對(duì)于需要消化傳代的細(xì)胞，每一次的消化都是對(duì)這個(gè)細(xì)胞存活與否，狀態(tài)好與不好*至關(guān)重要的考驗(yàn)。很多同學(xué)都遇到過(guò)這個(gè)問(wèn)題，自己養(yǎng)的細(xì)胞開始的幾代長(zhǎng)的還挺好的，可是穿過(guò)幾代之后就發(fā)現(xiàn)自己的細(xì)胞不行了，狀態(tài)越來(lái)越差勁了。對(duì)于這個(gè)問(wèn)題，可以非?？隙ǖ卣f(shuō)，你的消化環(huán)節(jié)出問(wèn)題了。你每一次的消化都讓細(xì)胞受到較大損傷了。所以，越長(zhǎng)越差。在消化的過(guò)程中，你加入胰酶后，所有細(xì)胞都在被胰酶消化著，但是我們忽視了一個(gè)問(wèn)題就是，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)是不一樣的，每一個(gè)細(xì)胞的貼壁情況也是不一樣的，有的貼壁牢固，有的貼壁沒(méi)有那么牢固的，所以，讓所有的細(xì)胞消化同樣的時(shí)間對(duì)細(xì)胞是不公平的，他們受到了差別待遇當(dāng)然會(huì)有脾氣啊。我后來(lái)對(duì)消化的方法進(jìn)行了改良。爭(zhēng)取做到因材施教呵呵。我稱之為“四步消化法”。（以難消化細(xì)胞為例）
具體操作：
1）.首先不加胰酶，倒掉舊培養(yǎng)基加入少量新培養(yǎng)基洗1-2遍，（這是前奏，即為**步，目的是將漂浮著的死細(xì)胞之類盡量洗掉。
2）.然后再加入少量新培養(yǎng)基直接吹打一遍，這一遍是把貼壁不牢固的細(xì)胞吹打下來(lái)。再用培養(yǎng)基洗一遍，兩次所得懸液混合傳入新瓶。即為**步（可以將這些傳入新瓶培養(yǎng)，以與后面胰酶消化過(guò)的細(xì)胞對(duì)比觀察看誰(shuí)長(zhǎng)的更好一點(diǎn)就知道該細(xì)胞對(duì)胰酶的敏感度了）。
3）.吸干凈瓶?jī)?nèi)剩余液體，加入0.3ml左右的胰酶潤(rùn)洗一遍，吸掉棄之，再加入1ml左右的胰酶消化。消化的同時(shí)置于顯微鏡下觀察，待細(xì)胞與細(xì)胞之間間隙明顯的時(shí)候立即吸掉胰酶與干凈子彈頭里備用，加入新培養(yǎng)基開始吹打，吹打2-3遍后吸取懸液于試管或新瓶暫存。用2ml左右新培養(yǎng)基洗一遍與前面的混合。（也可以傳入新瓶培養(yǎng)，以與后面及前面的做對(duì)比）這是第三步。
4）.然后把前面剛吸出來(lái)的胰酶重新加進(jìn)去瓶里繼續(xù)消化剩余的貼壁牢固的細(xì)胞。當(dāng)然你也可以用新的胰酶，如果你們那比較富裕的話，呵呵。繼續(xù)鏡下觀察，待剩余細(xì)胞間隙明顯，細(xì)胞獨(dú)立開來(lái)的時(shí)候，吸掉胰酶，加入新培養(yǎng)基吹打。懸液傳入新瓶培養(yǎng)（根據(jù)實(shí)際情況你自己把握）。這是第四步。
其實(shí)還可以有第五步，對(duì)于特別難消化的細(xì)胞和對(duì)胰酶特別敏感的細(xì)胞的話，你可以繼續(xù)加第五步甚至第六步。為了細(xì)胞更好的狀態(tài)，更漂亮的樣子，沒(méi)辦法，你必須分多批多次消化，這樣才能*大限度地將胰酶對(duì)細(xì)胞的損傷降到*低，保證細(xì)胞的狀態(tài)能夠。
當(dāng)然了，如果細(xì)胞是屬于那種很容易消化的細(xì)胞，像RAW264.7，僅僅**步就搞定了。就沒(méi)必要第三步第四步了。這個(gè)是需要你在實(shí)驗(yàn)中能夠自己用心去體會(huì)的。建議你接受一個(gè)新細(xì)胞時(shí)把各步消化的細(xì)胞分別培養(yǎng)起來(lái)做比較，去摸索好細(xì)胞對(duì)胰酶的要求。便于你后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展。
將細(xì)胞消化分成這幾步，除了是為了避免胰酶對(duì)細(xì)胞的損傷之外，還有一個(gè)更重要的作用就是，可以*大程度地把細(xì)胞吹打成單個(gè)單個(gè)的狀態(tài)，不成片不連體。
因?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)的時(shí)候肯定是要相互聯(lián)系，大部分的細(xì)胞都是要成片生長(zhǎng)的，尤其是對(duì)于貼壁細(xì)胞，單個(gè)細(xì)胞貼壁之后長(zhǎng)著長(zhǎng)著就長(zhǎng)到一片去了。但是如果是成片的細(xì)胞抱團(tuán)的話，傳代后細(xì)胞是不能貼壁的，這樣抱團(tuán)的細(xì)胞就會(huì)死亡。所以，消化傳代的時(shí)候一定要將細(xì)胞消化成單個(gè)單個(gè)的獨(dú)立狀態(tài)，這個(gè)啊是非常考究你的功夫的！
細(xì)胞一旦脫落入懸液里你很難再將他吹打成單個(gè)，因?yàn)樗麤](méi)有受力點(diǎn)了。很難找到受力點(diǎn)讓你對(duì)他吹打的力分散開細(xì)胞。所以必須要在細(xì)胞未脫落之前將其吹打開，受力點(diǎn)就是細(xì)胞貼壁的地方。這樣你就必須要嚴(yán)格控制好消化的程度啊，這和大師做飯掌握好火候是一樣的道理啊。既要消化到容易吹打下來(lái)，又不能太過(guò)，一吹就整片脫落，要單個(gè)單個(gè)地往下掉。所以我才要分批分次地加胰酶消化就是為了保證不同生長(zhǎng)狀態(tài)貼壁程度的細(xì)胞能夠都維持在好的受力點(diǎn)分散開。這個(gè)是很重要的一點(diǎn)。尤其是對(duì)于某些細(xì)胞這一點(diǎn)就是他活**的致命點(diǎn)。像Caco-2細(xì)胞就是如此。
另外關(guān)于傳代很重要一點(diǎn)就是一定不能等到細(xì)胞長(zhǎng)滿的時(shí)候才去消化傳代。要在細(xì)胞長(zhǎng)到70%左右的時(shí)候就要傳代了，一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)中已經(jīng)有疊層生長(zhǎng)的時(shí)候就要立即進(jìn)行消化傳代。不能再拖了。
2、關(guān)于換液傳代時(shí)候洗瓶的問(wèn)題
對(duì)于用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞，你在洗的時(shí)候如果是用無(wú)血清1640去洗細(xì)胞在隨即后的幾次中會(huì)比用DMEM洗的長(zhǎng)的要好。同樣，用1640培養(yǎng)的也有這個(gè)現(xiàn)象。
如果不嫌麻煩的話，可以用PBS來(lái)洗，洗的效果和用無(wú)血清培養(yǎng)基洗的效果基本上是一樣的，對(duì)于有些細(xì)胞會(huì)更勝一籌。洗的目的主要是洗去培養(yǎng)瓶里殘留的血清，防止它對(duì)胰酶的影響。這樣能夠保證胰酶的消化能力優(yōu)先，是很關(guān)鍵的一點(diǎn)。
傳代時(shí)PBS洗是很重要的一步，*近發(fā)現(xiàn)，用PBS就可以把細(xì)胞消化開來(lái)。加入PBS放置10-15分鐘，有些需要更長(zhǎng)的時(shí)間，等到細(xì)胞一個(gè)個(gè)分離開來(lái)的時(shí)候，就可以直接吹打下來(lái)，但是和胰酶消化一樣，要控制好時(shí)間，不能時(shí)間太過(guò)了，要不然損傷細(xì)胞，細(xì)胞不容易成活，狀態(tài)容易不好。這個(gè)方法對(duì)于某些細(xì)胞是很管用的。有些細(xì)胞用胰酶消化不容易消化成單個(gè)的時(shí)候，或者臨時(shí)沒(méi)有胰酶了，可以選用此方法。不過(guò)一定要試試，看是否適合你的細(xì)胞。